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三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的比较研究

发布日期:2015-05-22 10:49:14
纯化
大豆凝集素(Soybean Agglutinin,SBA)是指大 豆中能与N—乙酰基一D—半乳糖胺/半乳糖胺/半 乳糖特异性结合的糖蛋白,分子量约120kDa,由纯化四个略有不同的亚基构成四聚体,每个亚基分子量约 30kDa,在超速离心中随7S蛋白一起沉降自上 世纪中叶SBA被首次发现并命名以来,由于其具有 特殊的生物学功能(与游离的N—乙酰基一D~?半 乳糖胺/半乳糖或细胞膜糖蛋白上的N_乙酰基一 D—半乳糖胺/半乳糖结合),如今在抗营养作用、选 择性分离骨髓干细胞、分离糖蛋白、靶向给药、植物 分类学及人类血型鉴定等方面的研究越来越多。
 
获得高纯度的SBA是进行上述研究的前提。 提取和纯化SBA的方法较多,最初采用盐析、移动 界面电泳结合超速离心沉淀技术,但只能得到少量的SBAM,后来又发展了离子交换和磷酸钙层析 法[3<,而应用上述SBA的特殊生物学功能进行亲 和层析是近年来普遍采用的方法。其中最常用的亲 和层析体系是N—乙酰基一D_半乳糖胺一epoxy 一 Sepharose 6B[5’S]、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B[6W和瓜尔胶但这三种方法没有系统的研究, 本实验旨在比较三种亲和层析体系的差异,并确定 其中的最佳方法,以大量提取SBA,进而用于抗营 养研究。
 
1材料与方法1.1材料1.1.1试验样品三种亲和层析凝胶(N —乙酰基一D—半乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B、半乳糖 胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔胶)均购自Sigma公 司;大豆(丰交7607)购于吉林省春雨种子有限公 司。
 
1.1.2 主要试剂 SBA标准品购自Sigma公 司;硫酸铵、半乳糖等均为国产分析纯。
 
1.2.3主要仪器低温高速离心机(Sigma公司)、85—2磁力搅拌机(江苏金坛市金城国胜实验 仪器厂)、UV—2102PCS紫外可见光分光光度计 (龙尼柯仪器上海快3开奖结果)、恒温水浴(哈尔滨市东联电 子技术开发上海快3开奖结果)、BS —160型自动收集器(上 海沪西分析仪器厂)、PHS—3C型酸度计(上海伟业 仪器厂)等。
 
1.2方法1.2.1SBA粗提液的制备 称取生大豆100g, 粉碎过40 0标准筛,置于500mL低沸石油醚(馏程 3CTC?60‘C)内搅拌提取4h脱脂,晾干。用磷酸缓 冲液(PBS,0. 01mol/L,pH7. 6)4’C 下浸提过夜。 lOOOOr/m离心20min,弃沉淀。上清液中加入固体 硫酸铵至85%饱和度,4'C下搅拌2h,1000〇r/m离 心20min,弃上清。沉淀溶于PBS,并用PBS透析 过夜,离心除去少量杂质,上淸即为SBA粗提液。
 
1.2.2SBA的纯化 N—乙酰基一D—半乳糖 胺一epoxy — Sepharose 6B、半乳糖胺一CH — Seph?arose 4B 和瓜尔胶均 PBS 平衡处理后,前两种凝胶 分别装入1. 5 X 15cm的层析柱中,后者装人3 X 40cm的层析柱中。将SBA粗提液分批加人各柱, 用PBS洗去杂蛋白,反复几次,直至使凝胶的亲和 能力达到饱和(洗脱液中测不出SBA)。至流洗液OD2Mnm<0. 01?后。换用含 0. ImoVLD-半乳糖 (半乳糖胺一CH-Sepharose 4B和瓜尔胶)或〇。 15m〇l/LD-半乳糖(N-乙酰基一D—半乳糖胺一 epoxy—Sepharose 6B)的 PBS 洗脱,流速为 0. 5 mL/min(半乳糖胺一CH —Sepharose 4B和瓜尔胶) 或0. 8 mL/min(N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B),分管收集并合并 OD2Mnm>0. 1 的洗脱峰各管,即为纯化的SBA。
 
1.2.3SBA的含量测定以紫外吸收法测定SBA的含量。
 
1.2.4SBA的活性检测以兔红细胞凝集试验检测SBA的活性。按红细胞的凝集强度,以+ + + + (强凝集)、+ +十、+ +、+和一(不凝集)表示,以 出现+ +的SBA最高稀释倍数为凝集效价。
 
1.2.5SBA的纯度鉴定用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)对所提取的SBA进行纯度 分析。
 
2结果与分析图1 N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy — Sepha- rose 6B和半乳糖胺一CH—Sepharose 4B体系 纯化大豆凝集素曲线Fig. 1 Elution curve of SBA purification with Gal- NAc—epoxy — Sepharose 6B and GalNH2 — CH~ Sepharose 4B system由图1可见,半乳糖胺一CH —Sepharose 4B的 杂蛋白洗脱峰较N—乙酰基一D—半乳糖胺一epoxy -Sepharose 6B略早,而且蜂值高。这是由于N-乙 酰基_D—半乳糖胺对SBA的亲和力远大于半乳糖王利民等:三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的比较研究1期胺对SBA的亲和力。瓜尔胶层析柱的体积大,与 SBA的亲和力小,故两个峰收集的管数都较多,杂蛋 白洗脱峰值高,而SBA洗脱峰值低(图2、图3)。
 
2.2SBA产率及亲和饱和度根据纯化后SBA的终浓度和收集的总体积,计 算出其产率,即每l〇〇g生大豆经三种亲和层析柱纯 化后所得的SBA。亲和饱和度即每次上样后当层 53 析柱对SBA的结合达到最大时,每毫升凝胶所能结 合的SBA量。由表1可见,三种亲和体系中,N— 乙酰基一D—半乳糖胺一epoxy — Sepharose 6B的 产率最高,其次是瓜尔胶和半乳糖胺_CH—Sepha- r〇se4B,后二者差异不显着。三者的亲和饱和度差 异均较显着。
 
—>—005 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
 
图2瓜尔胶体系纯化大豆凝集素杂蛋白洗脱曲线 Fig. 2 Non—aimed protein elution curve of SBA purification with Guar system5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
 
图3瓜尔胶体系纯化大豆凝集素目的蛋白洗脱曲线 Fig. 3 Aimed protein elution curve of SBA purifica?tion with Guar system表1三种亲和层析体系的大豆凝集素产率和亲和饱和度比较12. 2 士 1.47. 5 士 1.3 2.1 士 1.6147.0士 15110.0士 12128.0士 16大豆凝集素SBA产率(mg/lOOg生大豆)亲和饱和度(mg/mL凝胶)
 
Production rateAbsorbing capacityN—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B GalNAc-epoxy—Sepharose 6B 半乳糖胺 _CH—Sepharose 4B GalNH2 — CH—Sepharose 4B 瓜尔胶Guar项目ItemTable 1 Comparison of production rate and absorbing capacity of SBA among the three affinity systems表2三种亲和层析体系纯化的大豆凝集素血凝效价比较Table 2 Comparison of agglutinating red blood cell effect of SBA among the three affinity systemsas P 件rmSample1* 24SBA 稀释倍数 Dilution times of SBA 8 16 32 64 1282565121024SBA标准品Standard sample+++++++++++++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++十纯化样品1Purified sample1++十十++++十十+++ +十+ + ++ + ++ ++ ++ ++十纯化样品2Purified sample2+ + + + 十+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ +++纯化样品3Purified sample3+ + + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++ +++注*1、2、3分别代表N—乙酰基一D_半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B、半乳糖胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔多糖凝胶纯化的SBA. *为SBA的起始浓度(lmg/mL)aNote:l ,2,3means SBA made by GalNAc—epoxy—Sepharose 6B, GalNHg—CH —Sepharose 4B and Guar gel.
 
* Indicates the initial concentration of SBAClmg /mL).
 
2.3 SBA的纯度由图4可见,三种亲和层析体系纯化的SBA'与 标准SBA的电泳结果一致,分子量约为30KDa,而 且没有任何杂蛋白带,表明所纯化的SBA纯度较 高。此结果与LotanW的报道一致。
 
2.4SBA的生物活性由表2可见,本试验中SBA的凝集效价均为 256。三种亲和层析体系纯化的SBA的效价与购买 的SBA标准样品没有显着差异。
 
虽然三种纯化体系都是亲和层析,但固相载体 上所连的配基不同,因而对SBA的特异性亲和力也 不同。N_乙酰基一D—半乳糖胺和半乳糖胺两种 配基分别以化学方法共价结合于作为固相“支架” epoxy—Sepharose 6B(环氧活化的琼脂糖凝胶6B) 和CH — Sepharose 4B(羧基琼腊糖凝胶4B)上,且 CH —Sepharose 4B 的结构较 epoxy—Sepharose 6B 疏松[1°],因而等量的体凝胶积,epoxy — Sepharose 6B结合N—乙酰基一D—半乳糖胺的位点多于CH —Sepharose 4B结合半乳糖胺的位点。而且N—乙 酰基一D—半乳糖胺对SBA的亲和力又是半乳糖 胺对SBA的亲和力的30倍[11],因此该体系的SBA 洗脱峰、产率和亲和饱和度都髙于半乳糖胺一CH_ Sepharose 4B体系。由于两种配基对SBA的特异 性亲和力不同,所以这两种体系所用半乳糖洗脱液 的浓度和流速也不同。
 
瓜尔胶是主要(约80%)由半乳糖和甘露糖聚 合而成的天然半乳多缩甘露聚糖,由原产于非洲的 一种豆科草本植物瓜尔豆种子的胚乳加工精制而成 的天然植物胶,为大分子天然亲水胶体。本试验显1期示,天然瓜尔胶对SBA的特异性亲和能力只有N_ 乙丑基一D — 半乳糖胺一epoxy—Sepharose 613的 约1/6、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B的约1/3,说 明SBA对半乳糖的亲和力远不如半乳糖胺和N — 乙酰基一D—半乳糖胺。
 
综上所述,用亲和层析法纯化大豆凝集素的最 理想方法是N—乙丑基一D—半乳糖胺_epoxy— Sepharose 6B体系,但价格较贵。瓜尔胶成本较低, 但产率也低。
 
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